Assisti a uma palestra de Josh Quick na PoreCampAU 2017, na qual ele discutiu algumas barreiras comuns para obter um bom rendimento de sequenciamento e um comprimento de leitura longo. Em geral, tudo se resume a ser mais cuidadoso com a preparação da amostra. Lembre-se de que o MinION ainda sequenciará uma amostra suja, mas com um rendimento reduzido. Aqui estão minhas notas dessa palestra:

• A coisa mais difícil sobre o sequenciamento MinION é obter a amostra em primeiro lugar
• Existem muitos tipos de amostra e métodos de extração diferentes
• Você não pode obter leituras mais longas do que o que você colocou; merda leva à merda
• O DNA é muito estável quando não se move, mas muito sensível a danos laterais
• O método de fenol clorofórmio de extração de DNA é muito bom e pode ser usado com um gel de fase bloqueada para facilitar a extração
• Uma extração simples de sal + álcool pode ser o melhor método de extração (porque envolve menos trabalho no DNA)
• EDTA (por exemplo, como encontrado no buffer TE, e muitos kits de extração) não é compatível com o kit rápido
• As execuções de Nanopore mais consistentemente boas produzidas pelo laboratório de Josh foram execuções de ligações 1D em R9.4; a melhor execução geral foi uma extração de fenol-clorofórmio + kit rápido
• John Tyson pode se desligar de um buraco de baixo rendimento (via software)
• Obter um pequeno número de leituras curtas é muito importante
• Técnicas de purificação sugeridas (e principalmente não testadas): coluna de rotação (60-100kb); extração com etanol (100-150kb), diálise (150-250kb); plug de agarose de baixo ponto de fusão (~ 1Mb, extração de DNA in situ)
• A entrada do protocolo nanopore está em nanogramas, mas deve realmente ser declarada como molaridade; o kit espera cerca de 0,2 pmol de entrada
• Moléculas de imagem presas à superfície da membrana. Você pode então ver que a densidade da célula de fluxo é independente do comprimento da sequência
• Tapestation, Qubit e Nanodrop são todas uma boa ideia; uma amostra de DNA que pode passar nos três testes funcionará bem: sem ombros curtos por Tapestation, DNA suficiente por Qubit, alta pureza por Nanodrop
• O RNA pode interferir com o sequenciamento; digerir RNA é recomendado
• Congelar DNA é uma péssima ideia. Os cristais de gelo são muito bons em cortar o DNA em pequenos pedaços
• O DNA que é mantido na geladeira é notavelmente estável; pode ser mantida por mais de dois anos (e provavelmente indefinidamente)

Atualização no rendimento:

Tivemos uma corrida em junho de 2018 que produziu cerca de 3 milhões de leituras de PCR- cDNA de camundongo amplificado (leia N50 de ~ 1kb), e que foi em uma situação em que foi a primeira amostra preparada por alguém, a quantidade de DNA de entrada foi provavelmente cerca de 20% do que deveria ser, e sofremos um incidente de perda de dados . Se foi isso que aconteceu com uma execução ruim, tenho grandes esperanças para nossas execuções no futuro.

Nossa próxima execução de cDNA em agosto de 2018 produziu cerca de 7 milhões de leituras e uma leitura semelhante N50 (ou seja, rendimento total de cerca de 7 Gb). A execução foi interrompida por uma atualização do Windows durante a primeira noite (eu havia desabilitado as atualizações automáticas anteriormente, mas elas foram reativadas) e desde então houve atualizações adicionais de software e hardware para melhorar o rendimento do sequenciamento. Se tivermos uma boa célula de fluxo e uma preparação de amostra semelhante, espero que a próxima execução de cDNA que faremos deve produzir mais de 8 milhões de leituras e possivelmente mais de 10 milhões.

Minha aposta é que o pessoal do nanopore (claro!) fez uma tonelada de otimização em duas coisas principais:

1. A limpeza do DNA
2. Os preparativos da biblioteca

Acho que, para a maioria das extrações de DNA, as limpezas podem variar muito, mas algo como um Blue Pippin fará um trabalho excepcional se você tiver acesso a um e puder usá-lo (eles não funcionarão para fragmentos de DNA SUPER longos que não podem se mover através de um gel, é claro). O Blue Pippin também faz sua seleção de tamanho, para que você não queime os poros sequenciando muitas pequenas coisas. Isso deve ajudar a render também.

Então, tudo depende da preparação da biblioteca, e a resposta de @gringer tem algumas boas dicas sobre isso.

Estou trabalhando com um fungo e estou usando o método CTAB para extração de DNA e usei o kit rápido para a preparação inicial da minha biblioteca, mas não funcionou e desde então tenho usado o kit de ligação e tem me dado resultados muito bons . Consegui obter dados que variam de 4 GB a 13 GB.