Não acho que você pode concluir que o conjunto de dados é terrível com base naquele PCA. Dependendo do protocolo específico, cada conjunto de dados scRNA-seq será muito diferente. Ao contrário do bulk RNA-seq, onde todas as amostras serão de qualidade muito semelhante, as células individuais serão altamente variáveis. Por exemplo, a métrica de QC mais básica é o número de leituras. Se algumas de suas amostras de RNA-seq em massa têm 10 vezes mais leituras do que outras amostras, isso é motivo de preocupação. Em experimentos de scRNA-seq, isso não é nada surpreendente. O PCA expõe as principais fontes de variação. No experimento scRNA-seq, eles provavelmente serão técnicos, em vez de biológicos, portanto, a saída pode não fazer muito sentido. Além disso, mesmo se todas as células forem de qualidade perfeita, o PCA não é realmente ideal para dados esparsos com muitas perdas, como você vê com scRNA-seq.

Independentemente do PCA, esses tamanhos de biblioteca parecem muito pequenos. Com base em seu gráfico, quase não existem células com mais de 10K leituras. Eu entendo que isso é C elegans, mas parece um pouco baixo. Pode ser por isso que você está tendo problemas com a normalização. Ajudaria a entender os dados se você alterasse o eixo X nesses gráficos para que pudesse realmente ver onde está o pico. No momento, parece 0, mas não pode ser o caso.

Normalmente uso um mínimo de 200 genes / célula para filtros relaxados (500 se possível). Para genes, uso a presença em pelo menos 10% das células.

Alguns outros filtros que você pode tentar são:

• Alta porcentagem de leituras de apenas 50 genes principais. Isso significa que você não capturou muitos genes e a diversidade da célula não será útil.
• Alta porcentagem de genes mitocondriais. Foi relatado que isso está relacionado a células de má qualidade. A ideia é que o mRNA é esgotado por causa da morte celular precoce (ou outra lesão da membrana externa) levando a ter apenas mRNA mito restante.
• Mínimo UMI por células. Semelhante aos genes mínimos, mas mais dependente do protocolo usado.
• UMI por gene / célula. Isso pode ser interessante para detectar um viés potencial da amplificação e também depende do protocolo.

O melhor seria comparar todas as suas amostras usando gráficos de violino com esses diferentes filtros e escolher seus limites a partir daí. Um exemplo rápido (usando Seurat):

Pré-filtragem:

Filtragem de postagem:

Dado que se trata de resultados de sequenciamento de célula única, você deve usar rowSums em vez de rowMeans para filtrar genes. A maioria dos genes não será expressa em um único nível de célula, mas deve haver muitos genes com alguma expressão. As contagens zero são provavelmente melhor representadas como "ausentes" em vez de zero.

Infelizmente, esse recurso torna a execução de PCAs difícil, porque os PCAs não funcionam com valores ausentes. Os valores ausentes podem precisar ser imputados a fim de gerar um PCA melhor.

isenção de responsabilidade: Eu [normalmente] não trabalho com dados de célula única, então não tenho um bom controle sobre os métodos para olhando para ele.