Você pode considerar o uso de RUVSeq. Aqui está um trecho da publicação Nature Biotechnology de 2013:

Avaliamos o desempenho dos controles de spike-in do External RNA Control Consortium (ERCC) e investigamos a possibilidade de usando-os diretamente para normalização. Mostramos que os spike-ins não são confiáveis ​​o suficiente para serem usados ​​em escala global padrão ou procedimentos de normalização baseados em regressão. Propomos uma estratégia de normalização, chamada de remover variação indesejada (RUV), que se ajusta para efeitos técnicos incômodos, realizando análise fatorial em conjuntos adequados de genes de controle (por exemplo, ERCC spike-ins) ou amostras (por exemplo, bibliotecas replicadas) >

RUVSeq essencialmente ajusta um modelo linear generalizado (GLM) aos dados da expressão, onde sua matriz de expressão $ Y $ é uma matriz $ m $ por $ n $, onde $ m $ é o número de amostras e $ n $ o número de genes. O modelo se resume a

$ Y = X * \ beta + Z * \ gamma + W * \ alpha + \ epsilon $

onde $ X $ descreve as condições de interesse ( por exemplo, tratamento vs. controle), $ Z $ descreve as covariáveis ​​observadas (por exemplo, gênero) e $ W $ descreve as covariáveis ​​não observadas (por exemplo, lote, temperatura, laboratório). $ \ beta $, $ \ gamma $ e $ \ alpha $ são matrizes de parâmetros que registram a contribuição de $ X $, $ Z $ e $ W $, e $ \ epsilon $ é ruído aleatório. Para o subconjunto de genes cuidadosamente selecionados (por exemplo, spike-ins ERCC, genes de manutenção ou réplicas técnicas), podemos assumir que $ X $ e $ Z $ são zero e encontrar $ W $ - a "variação indesejada" em sua amostra.

Adicionamos spike-ins ERCC a todos os nossos dados RNASeq, apenas no caso de outras pessoas acharem que é útil no futuro. No entanto, nunca o usei em minhas próprias análises porque não consigo pensar em uma maneira razoável de usá-lo.

A recomendação típica para ERCC é adicioná-lo em proporção à quantidade de RNA de entrada , mas isso pressupõe que as contagens de RNA de células totais são semelhantes em células diferentes (o que é comprovadamente falso ao olhar para os resultados de RNASeq de uma única célula).

Ainda estou para pensar em uma situação em que ERCC forneceria melhor resultados do que um conjunto de genes "housekeeping" amostrado a partir das leituras originais.